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上海西宝生物科技有限公司官方博客

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二抗常见应用之Western Blotting  

2017-03-08 14:15:02|  分类: 抗体 |  标签: |举报 |字号 订阅

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Jackson ImmunoResearch二抗产品久经考验,被众多文献使用认证,专业提供适用于Western Blotting的众多具有种属特异性的二抗品种,包括辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、生物素标记的抗体及链霉亲和素,可用于传统的底物显色及底物化学发光(ECL)的免疫印迹技术。同时,Jackson ImmunoResearch提供覆盖红外光谱范围的多种染料标记二抗,适用于最新的多色图片采集处理系统。
西宝生物作为全球二抗领导者Jackson ImmunoResearch的官方授权代理商,渠道正规,并备有大量现货,抢购热线:400-021-8158
建议操作稀释范围及PAP复合物
Jackson ImmunoResearch专业提供亲和纯化的辣根过氧化物酶—抗辣根过氧化物酶复合物(PAP),可用于检测HRP或增强HRP复合物分子的信号。
可溶性PAP复合物
货号
浓度
规格
山羊Goat PAP
123-005-024
20 mg/ml
0.25 ml
老鼠Mouse PAP
223-005-024
20 mg/ml
0.25 ml
兔Rabbit PAP
323-005-024
20 mg/ml
0.25 ml
Jackson ImmunoResearch标记抗体、链霉亲和素及PAP复合物建议稀释范围如下表所示:
产品
化学发光
显色
HRP-Antibody
1:10K - 1:200K
1:5K - 1:100K
Alkaline Phosphatase-Antibody
1:5K - 1:50K
1:5K - 1:50K
Biotin-Antibody
1:20K - 1:400K
1:20K - 1:400K
Alexa Fluor? 680 and 790-Antibody
1:50K - 1:200K
1:50K - 1:200K
HRP-Streptavidin
0.01 - 0.1 μg/mL
1 - 2 μg/mL
Alkaline Phosphatase-Streptavidin
0.1 - 1.0 μg/mL
1 - 2 μg/mL
PAP
1:5K - 1:100K
1:5K - 1:100K
WB适用的荧光染料标记二抗
Alexa Fluor?680是一种激发波长702nm,发射波长684nm的远红外荧光染料。Alexa Fluor?790为激发波长803nm,发射波长783nm的红外发光染料(图1)。由于低荧光猝灭、高消光系数和低的背景荧光,使得抗体结合远红外及红外发光染料比可见光更灵敏。
标记二抗的Alexa Fluor?680和Alexa Fluor?790的激发和发射光谱
图1 标记二抗的Alexa Fluor?680(左)和Alexa Fluor?790(右)的激发和发射光谱
远红外及红外荧光染料适用于高灵敏度的免疫印迹,定量免疫印迹(quantitative Western blots),凝胶印迹(in-gel Western blots),微印迹分析(microWestern arrays),in-cell Western arrays,on-cell Western arrays microwestern,组织切片成像,小动物全身成像及其他需要强光的技术。
免疫沉淀后WB实验二抗的选择
针对免疫沉淀后的Western Blotting研究,Jackson可提供特异性针对轻链或Fc片段的抗体,分别检测分子量50kDa及25kDa以上的抗原。当使用特异性标记重链和轻链的二抗,如抗IgG(H+L),进行免疫沉淀后的Western Blotting检测,重链与轻链的分子量大小分别约为50 kDa、25 kDa(图2A)。当使用特异性标记轻链的IgG轻链二抗(图2B)时,仅结合到一抗的轻链上。
使用HRP标记的羊抗鼠IgG与使用特异性针对轻链的IgG 轻链二抗电泳图谱比较
图2 使用HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)能够检测出重链(50kDa)及轻链(25kDa);而使用特异性针对轻链的IgG 轻链二抗,即使在IgG过载的情况下,亦不能够检测出重链。
因此,50kDa左右的蛋白检测为避免重链的干扰,可以选用轻链特异性的二抗,从而将IP或者Co-IP中的面临的重链干扰降到最低;同理,25kDa左右的蛋白检测为避免轻链的干扰,可以选用Fc片段特异性的二抗。
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