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【转载】核酸电泳常见问题及解决方案  

2014-02-28 10:09:15|  分类: 电泳分析 |  标签: |举报 |字号 订阅

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问题

可能原因

解决方法

DNA Marker降解

核酸酶污染

每次吸取时更换灭菌枪头,勿将电泳缓冲液带入管中;用后密闭4°C保存

保存不当

4°C -20°C保存,避免多次反复冻融;不可加热

DNA Marker无法正确分离

琼脂糖质量差

使用质量可靠的琼脂糖制胶

电泳缓冲液多次使用后失效

更换缓冲液

条带黯淡

核酸浓度过低

增加上样量

核酸降解

使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品

DNA条带被示踪染料掩盖

提高上样量;避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料

条带模糊或弥散

电泳缓冲液多次使用后失效

更换缓冲液

核酸部分降解

使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品

核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份

/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质

电压过低,电泳时间过长

根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳

染色时间过长或拍照前放置过久,DNA条带弥散

电泳结束后及时观察、拍照

条带缺失

DNA条带分子量过大

使用脉冲凝胶电泳

分子量接近的DNA条带没有分开

选择适当的凝胶浓度进行电泳

电泳缓冲液使用不当

SDTBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段,大片段分子不能完全分离;TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段

电泳时间过长或电压过高,DNA走出凝胶

缩短电泳时间,调整电压

电极插反,DNA走出凝胶

正确连接电极方向

条带大小不正确

核酸降解或形成聚合物

加热处理或重新制备样品

λ DNA酶切Markercos位点复性

电泳前65°C加热5分钟,冰上冷却5分钟以后再上样

相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率

判断DNA分子是否有特殊结构,如缺口、超螺旋、二聚体等;富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢

梳子变形,点样孔不在同一水平线上

使用完好的梳子制胶

带型异常

不同样本的上样条件不同

选用相同的上样缓冲液,上样量尽可能接近

上样量过大或过小

选择合适大小的上样孔,样品应完全覆盖点样孔底部

核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份

/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质

电泳缓冲液未完全浸没凝胶

上样和电泳时,确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶

电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性

根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳

凝胶中加入EB造成染色不均

加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色

凝胶中有气泡或污染物

使用纯水和洁净容器制胶;缓慢灌胶,并赶除气泡

点样孔质量差

待凝胶完全凝聚后再取出梳子;

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